TFF-tangential flowfiltrering kombineret med ultracentrifugering til effektiv små ekstracellulær vesikelforberedelse

Små ekstracellulære vesikler (sEV'er) er nanoskala vesikler udskilt af celler, der indeholder nukleinsyrer, proteiner, små molekyler og andre komponenter og spiller en vigtig rolle i intercellulær kommunikation. Små ekstracellulære vesikler af exosome-type har store ligheder med deres forældreceller. Sammenlignet med kunstige nanopartikler udviser de lavere immunclearance-hastigheder og lavere cytotoksicitet, hvilket gør dem til lovende kandidater som nyein vivo lægemiddelleveringsbærere. Næsten alle typer celler kan udskille disse vesikler, og forskning i deres anvendelse som lægemiddelbærere bevæger sig gradvist fra laboratoriet mod kliniske anvendelser. Imidlertid,stor-produktion er fortsat en stor flaskehals.

 

Nuværende metoder til ekstracellulær vesikelisolering

Nuværende ekstracellulære vesikelisoleringsmetoder omfatterultracentrifugering, tæthedsgradientcentrifugering, størrelse-eksklusionskromatografi (SEC) og polyethylenglycol (PEG) udfældning.

PEG-udfældning giver højt udbytte og enkel betjening, men det er forbundet med betydelig forurening af uønskede proteiner. Tæthedsgradientcentrifugering og størrelses-udelukkelseskromatografi kan give produkter med høj-renhed, men deres effektivitet er relativt lav, og processerne er tidskrævende-. Ultracentrifugering er meget udbredt, men dens behandlingsvolumen er begrænset af centrifugekapacitet, hvilket gør det vanskeligt at skalere op.

 

Anvendelse af Tangential Flow Filtrering til sEV Separation

Tangential flow filtration (TFF) er allerede blevet anvendt til adskillelse af nanopartikler såsom liposomer og lentivirale vektorer. I TFF flyder foderet tangentielt hen over membranoverfladen, hvilket hjælper med at reducere membrantilsmudsning og gør processen nemmere at skalere op.

Da små ekstracellulære vesikler generelt spænder fra30-200 nmi diameter, en0,45 μm membrankassettekan vælges i TFF-systemet til at fjerne større proteiner og vesikler, mens en300 kDa membrankassettekan bruges til at fjerne små molekylære-proteiner og koncentrere de små ekstracellulære vesikler, der er til stede i dyrkningsmediet.

 

Karakterisering af råmaterialet efter TFF-separation

Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) viste, at partikeldiametrene hovedsageligt var fordelt inden for området af0-250 nm.

 

 

Imidlertid afslørede transmissionselektronmikroskopi (TEM) en stor mængde kontaminerende protein, mens der ikke blev observeret ekstracellulære vesikler. Disse resultater indikerede, at et yderligere nedstrøms oprensningstrin var påkrævet for yderligere at oprense de ekstracellulære vesikler.

 

Karakterisering af TFF-koncentratet efter 100 kDa ultrafiltrering

TFF-koncentratet blev yderligere forarbejdet ved anvendelse af en100 kDa ultrafiltreringsrør.

NTA viste, at partikeldiametrene i koncentraterne opnået efter en og to runder med ultrafiltrering hovedsageligt forblev inden for området af0-250 nm. Udførelse af ultrafiltrering to gange resulterede imidlertid i en signifikant reduktion i antallet af opnåede partikler.

TEM-analyse viste, at der ikke blev observeret nogen vesikellignende strukturer i hverken en-- eller to-ultrafiltreringskoncentraterne, mens der var en betydelig mængde kontaminerende protein tilbage.

Derfor,100 kDa ultrafiltrering kunne ikke effektivt anvendes til at rense dyrkningsmediet efter TFF-koncentration.

 

 

Karakterisering af TFF-koncentratet renset ved ultracentrifugering

NTA viste, at partikeldiametrene for de rensede produkter hovedsageligt var fordelt inden for intervallet af0-250 nm.

Det er vigtigt, at TEM tydeligt afslørede vesikellignende strukturer- på tværs af forskellige synsfelter. Disse resultater viste, at efter koncentrering af dyrkningsmediet under anvendelse af TFF,ultracentrifugering kan efterfølgende anvendes til yderligere adskillelse og oprensning af ekstracellulære vesikler.

 

 

Karakterisering af sEV'er isoleret fra mesenkymalt stamcellekonditioneret medium ved hjælp af TFF kombineret med ultracentrifugering

NTA viste, at partikeldiametrene for de rensede produkter hovedsageligt var fordelt inden for intervallet af0-250 nm.

Blære-lignende strukturer blev observeret af TEM. Western blot-analyse viste positiv ekspression af de ekstracellulære vesikel-associerede proteinerCD9, CD63 og ALIXi de oprensede ekstracellulære vesikler.

Disse resultater bekræftede, at de oprensede små ekstracellulære vesikler indeholdt exosomer, hvilket indikerer, at denne metode også kan bruges tilexosom isolation og ekstraktion.

 

 

Konklusion: TFF kombineret med ultracentrifugering til sEV-forberedelse af høj-kvalitet

Det viste undersøgelsenTFF-koncentration aleneresulterede i et produkt indeholdende en betydelig mængde kontaminerende proteiner og var derfor utilstrækkelig til at opnå kvalificerede ekstracellulære vesikler.

Ligeledes ved hjælp af en100 kDa ultrafiltreringsrør til sekundær oprensninggav ikke effektivt intakte vesikelstrukturer.

Ved at kombinere TFF-koncentration med efterfølgende ultracentrifugeringsrensning kan fordelene ved begge teknikker integreres for at opnåsmå ekstracellulære vesikelprodukter af høj-kvalitet.

Sammenlignet med konventionel ultracentrifugering alene, kan den kombinerede proces effektivtreducere den samlede behandlingstid og forbedre separationseffektiviteten.

I denne arbejdsgang,TFF muliggør hurtig berigelse af store-volumenprøver, der adresserer begrænsningen af ​​konventionel ultracentrifugering ved behandling af store prøvevolumener. Ultracentrifugering udfører derefter dyb oprensning for at fjerne co-koncentrerede proteinurenheder, samtidig med at det hjælper med at bevare renheden og integriteten af ​​vesiklerne.

Endvidere kræver processen ikke tilføjelse afeksogene kemiske udfældningsreagenser, der hjælper med at bevare den biologiske aktivitet af vesiklerne i størst muligt omfang.

Set fra industriel oversættelses perspektiv har denne proces betydningopskalere-potentialeog kan hjælpe med at løse de udfordringer, der er forbundet med stor-produktion af ekstracellulære vesikler tillægemiddellevering, regenerativ medicin og relateret produktudvikling. Det giver også et solidt eksperimentelt grundlag for efterfølgende procesoptimering og pilot--skalaproduktion.

 

Reference

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.Etablering af en metode til adskillelse af små ekstracellulære vesikler ved Tangential Flow Filtrering kombineret med ultracentrifugering. Chinese Journal of Biologicals, 2022, 35(9): 1096-1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.