Videnskabeligt gennembrud|Separations- og oprensningsproces for rekombinant humaniseret type II kollagen

Type II kollagen er et strukturelt protein, der hovedsageligt findes i bruskvæv. Det giver støtte og dæmpning til leddene og hjælper med at bevare bruskens mekaniske egenskaber og strukturelle integritet. Det har et betydeligt anvendelsespotentiale i fælles sundhedspleje og bruskvævsteknik.

 

Sammenlignet med traditionelle ekstraktionsmetoder tilbyder rekombinant kollagen produceret gennem mikrobiel værtsfermentering stabil kvalitet, god biokompatibilitet og ingen risiko for viral kontaminering, hvilket gør det til et stort forskningsfokus. Rekombinant humaniseret type II kollagen produceret ved fermentering under anvendelse af manipuleret *Pichia pastoris* har tiltrukket sig betydelig forskningsinteresse. De høje omkostninger og kompleksiteten af ​​separation og oprensning er dog stadig store udfordringer i etableringen af ​​en effektiv proces til industriel-skalaproduktion af rekombinant kollagen.

 

Et forskerhold fra School of Life Sciences and Medical Engineering ved Anhui University har i samarbejde med Anhui Zhongsheng Anlan Health Industry Co., Ltd. udviklet en komplet separations- og oprensningsproces for rekombinant humaniseret type II kollagen II-23k baseret på Tangential Flow Filtration (TFF) kombineret med DEAE-svag anionudveksling{{}}-mode{4} , hvilket giver en gennemførlig løsning til storskalaproduktion.

 

Komplet industriel-skalarensningsproces

Hele processen består af fire hovedtrin:

Klargøring Filtrering → Koncentration og diafiltrering → DEAE-søjleflow-Gennem kromatografi → Fryse-Tørring

 

Figur 1. Separations- og oprensningsproces for rekombinant humaniseret type II kollagen II-23k

 

Nøgleprocesscreening

Forskerholdet sammenlignede fire typer ion-udvekslingskromatografimedier: Q stærk anion-udveksling, DEAE svag anion-udveksling, SP stærk kation-udveksling og CM svag kation-udvekslingskolonner.

 

Among them, the DEAE weak anion-exchange column showed the best performance. Under a buffer condition of pH 7.0 , the column was operated in flow-through mode , achieving a target protein purity of >95% and a recovery rate of >90 % uden detektering af restpigmenter.

 

Separations- og oprensningsprocesserne for forskellige rekombinante kollagener udtrykt af forskellige mikrobielle værter varierer betydeligt. Generelt kan den overordnede strategi dog opdeles i primær separation og finrensning.

 

Formålet med primær adskillelse er at fjerne fast suspenderet stof såsom mikrobielle celler og forberede fermenteringsbouillonen til efterfølgende finrensning. Denne fase involverer hovedsageligt centrifugering og filtrering. Konventionelle industrielle centrifuger er generelt store i størrelse, dyre og begrænsede i omdrejningshastighed, hvilket resulterer i relativt lav forarbejdningseffektivitet. Tangential Flow Filtration (TFF) har lavere driftsomkostninger og reducerer effektivt membrantilstopning og tilsmudsning forbundet med konventionel blind{3}}filtrering. Derfor er TFF blevet anvendt i vid udstrækning til klaringsfiltrering og koncentration/diafiltrering af fermenteringsbouillon, der indeholder rekombinante proteiner.

 

Formålet med finrensning er at forbedre produktets renhed yderligere ved at fjerne urenheder såsom værts-celleproteiner og pigmenter gennem kromatografiske teknikker. Blandt disse teknologier tilbyder ionbytningskromatografi- høj opløsning og stærk selektivitet og bruges i vid udstrækning til stor-produktion af forskellige biomolekyler.

 

I industriel produktion stiller ion-kromatografi relativt høje krav til prøveafklaring og ionstyrke. I mellemtiden kan TFF håndtere store mængder fodermateriale, er let at vedligeholde og tilbyder god skalerbarhed, hvilket gør det bredt anvendeligt til nedstrøms oprensningsprocesser for bioprodukter.

 

Ved etablering af separations- og oprensningsprocessen for II-23k blev der derfor brugt en 0,22 μm TFF hulfibermembran til klaringsfiltrering af fermenteringsbouillonen for at fjerne mikrobielle celler og andre faste urenheder. En 5 kDa TFF flad-arkmembrankassette blev derefter brugt til koncentrering og diafiltrering, hvilket afsluttede forbehandlingen før kromatografi. Endelig blev DEAE-søjlekromatografi i gennemstrømningstilstand anvendt til oprensning.

 

Resultaterne viste, at processen fungerede effektivt og opnåede en slutproduktrenhed på ca. 95 %, uden at der blev påvist resterende pigmenter. Den samlede genvindingsgrad for hele processen nåede næsten 60 %.

 

Yderligere forbedringer i genvinding kan opnås ved at øge fødevolumenet og reducere membrankassettens trykmåleraflæsning under koncentrations- og diafiltreringstrinnet. Genvindingen af ​​kromatografitrinnet kan potentielt forbedres ved at sænke kromatografiens driftstemperatur og øge saltionkoncentrationen i bufferen.

 

Reference

Meng Zixuan, Shi Weiwei, Zhang Maifei, et al. Separations- og oprensningsproces for rekombinant humaniseret type II kollagen. *Chinese Journal of Biology*, 2026, 43(1): 91–96.