300kd hulfiberultrafiltrering: Analyse af en høj-effektiv koncentrations- og oprensningsproces for mund-- og-O/A-virus til mundsyge
Sep 03, 2026| Indledning
Mund-og-mundsyge (MKD) er en akut, febril og meget smitsom dyresygdom forårsaget af mund-- og-mundsygevirus (FMDV). Denne virus påvirker kløvede-hovdyr med over 70 modtagelige arter. Det spreder sig hurtigt og har en høj sygelighedsrate, der typisk rammer større husdyr såsom svin, får og kvæg, hvor forekomsten kan nå op på 100%. FMDV tilhører slægtenFod--og-mundvirusaf familien MicroRNAviridae. Partiklerne er sfæriske, ca. 27-30 nm i diameter, med en sedimentationskoefficient på 146S for intakte viruspartikler. I øjeblikket er forskellige MKS-vacciner tilgængelige, herunder svækkede levende virusvacciner, levende virusvektorvacciner, inaktiverede vacciner, nukleinsyrevacciner, syntetiske peptidvacciner og underenhedsvacciner. Inaktiverede MKS-vacciner har generelt færre bivirkninger hos dyr, og multivalente vacciner giver bedre immuniseringseffektivitet, hvilket gør dem til grundpillen i forebyggelsen af MKS i Kina.
Tangential Flow Ultrafiltration
I øjeblikket er tangentiel flow-ultrafiltrering en almindeligt anvendt oprensnings- og koncentreringsmetode i stor-produktion af mund--- og-multivalent inaktiveret mundsygevacciner. Denne metode opnår ikke kun den ønskede koncentrationsfaktor, men fjerner også en stor mængde fremmede urenheder. Tangential flow ultrafiltrering bruges hovedsageligt til oprensning, koncentration og filtrering (afsaltning og bufferudskiftning). Derudover kan den også bruges til klaring af fermenteringsbouillon eller celledyrkningsmedium ved hjælp af tangential flow mikrofiltrering, og dermed erstatte centrifugering eller primær klaring.
Ved konventionel vertikal filtrering har store molekyler en tendens til at samle sig på membranoverfladen og tilstoppe filteret. Tangentiel flowfiltrering tillader imidlertid flowet at fortsætte parallelt med membranen, hvilket undgår dette tilstopningsproblem. Ved tangentiel flowfiltrering kaldes opløsningsmidlet og stoffer mindre end membranporestørrelsen, der trænger gennem membranen, for permeatet, mens stoffer større end porestørrelsen tilbageholdes som koncentratet. Kombineret med optimerede vaske- og filtreringsprocesser kan separation og oprensning af molekyler af varierende størrelse opnås. Denne teknologi tilbyder fordele såsom lave omkostninger, milde driftsforhold, bekvem rengøring og udskiftning, høj membrangennemtrængningsflowhastighed og enkel betjening, hvilket gør den særligt velegnet til stor-koncentrering og oprensning af bioaktive stoffer.
Materialer og metoder
Hulfibersøjle:Molekylvægt cutoff på 300kd, membranareal på 1600cm².
Materialer:5,6 L hver af supernatanten fra FMDV type O og type A efter centrifugering og klaring.
Proces parametre:Under ultrafiltreringskoncentration blev forskydningskraften justeret til ca. 3000-1, og TMP blev kontrolleret til ikke at være højere end 10 psi. Da koncentrationsfaktoren nærmede sig 11 gange, blev prøven vasket med 6CV bufferopløsning. Efter vask blev steril luft indført i indløbsrøret, og al den koncentrerede prøve i røret blev injiceret i prøvekoncentrationsflasken. Derefter blev sterilt PBS tilsat for at skylle slangen, indtil det endelige volumen af den koncentrerede væske var 500 ml, hvorved den samlede genvindingshastighed blev forbedret.
Resultater og diskussion
Med hensyn til initial virusrensning opnår ultrafiltreringskoncentrationen en fjernelseshastighed på over 90 % for urenheder såsom proteiner, der ikke indeholder vira. Volumenmæssigt kan den opnå høje koncentrationer på 10-50 gange, hvilket giver stærk støtte til efterfølgende oprensning. En hulfibersøjle med en molekylvægtsgrænse på 300 kd vælges. Denne porestørrelse kan, mens den bevarer over 85 % af virussen, fjerne over 90 % af urenhedsproteinerne. Membranarealet er 1600 cm², og gennemløbet er 2-5 ml/cm², hvilket gør det muligt at afslutte ultrafiltreringskoncentrationen inden for en effektiv tid (inden for 2 timer). Detaljerede ultrafiltreringskoncentration og oprensningsdata er vist i tabel 1.
Tabel 1. Resultater af total påvisning af mund--og-klovsygeantigener (type O og A)
| Eksempelnavn | Flydende foder | Volumen (ml) | 146S Indhold (ug/ml) | 146S gendannelsesrate (%) | Proteinkoncentration (ug/ml) | Proteinfjernelseshastighed (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| O-type | Original løsning | 5600 | 2.53 | 87.94 | 5040 | 94.38 |
| O-type | Koncentrere | 500 | 24.92 | 87.94 | 3170 | 94.38 |
| En-type | Original løsning | 5600 | 3.37 | 94.80 | 5980 | 93.55 |
| En-type | Koncentrere | 500 | 35.78 | 94.80 | 4318 | 93.55 |
Oprensningsmetodeovervejelser
I øjeblikket er der forskellige oprensningsmetoder, men selv med den samme metode for det samme antigen, er oprensningseffekten ofte utilfredsstillende af mange årsager, herunder antigenkarakterisering og procesparametre. For eksempel kan ændringer i opstrøms molekylært design eller fermenteringskultursystemer ændre den virale molekylære struktur, hvilket fører til utilfredsstillende oprensningsresultater. Uhensigtsmæssige klaringsmetoder kan øge råvareomkostningerne eller mængden af heterologt protein, hvilket øger presset på nedstrøms oprensning. Forkert ultrafiltreringskoncentration, såsom forskellige ultrafiltreringsmembranporestørrelser, koncentrations- og elueringsfaktorer, indløbsstrømningshastigheder, filtreringshastigheder og TMP, kan resultere i lave antigengenvindingshastigheder. Omfattende praksis viser, at dårlig oprensning kan forårsage betydelige bivirkninger hos dyr efter immunisering, hvilket potentielt kan føre til døden.
Konklusion:Denne undersøgelse viser, at i tangentielle strømningsprocesser, ved at vælge passende membranporestørrelse (300 kd), vaskeforhold, indløbsstrømningshastighed og TMP, kan både høj genvindingshastighed og maksimal urenhedsfjernelse sikres.